【薄層色譜法】

1.薄層層析（TLC）法

TLC 法是測(cè)定黃曲霉毒素的經(jīng)典方法，在薄層板展開后，在365 nm紫外燈下，黃曲霉毒素B1，B2，G1和G2分別顯示紫色、藍(lán)紫色、綠色和綠色熒光。TLC 法的特異性較差，靈敏度相對(duì)較差，且測(cè)定黃曲霉毒素專一性不夠，經(jīng)常引起測(cè)量誤差。但由于此法設(shè)備簡(jiǎn)單，易于普及，所以國(guó)內(nèi)外仍在使用。

2.薄層（HPTLC）法

HPTLC 法測(cè)定黃曲霉毒素采用目前上流行的樣品處理方法——固相萃取法（SPE）中針對(duì)真菌和病毒的多功能凈化（MFC）柱。采用MFC柱凈化后，僅用單相展開即可達(dá)到分離測(cè)定的目的，不僅節(jié)省了工作時(shí)間，提高了工作效率，而且進(jìn)一步減少了有毒有害溶劑的用量。Stroka等將免疫親合柱凈化應(yīng)用于 TLC法測(cè)定，進(jìn)行單相展開并用熒光密度計(jì)定量，此方法能檢測(cè)含量明顯低于當(dāng)前歐盟標(biāo)準(zhǔn)的黃曲霉毒素。Kamimura 等用HPTLC方法測(cè)定玉米、花生、蕎麥等樣品，并與通過公職分析化學(xué)家協(xié)會(huì)（AOAC）認(rèn)證的分析花生及花生制品中黃曲霉素的*方法CB（Contamination Branch）法和 BF（Best Foods）法進(jìn)行比較，4種主要黃曲霉毒素的檢測(cè)限均不高于0.2μg／kg，回收率與CB法一樣均高于BF法。

3.高壓薄層色譜（OPTLC）法

高壓薄層色譜于1979年由Tyihak提出，它結(jié)合了經(jīng)典薄層色譜法、薄層色譜法與液相色譜法的優(yōu)點(diǎn)，是一種能夠提高薄層分離效率的平面液相色譜技術(shù)。隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷成熟，OPTLC 法在飼料和食物中黃曲霉毒素的檢測(cè)方面的應(yīng)用越來越多。Eszter Papp等發(fā)展了一系列適合檢測(cè)玉米和小麥中黃曲霉毒素的OPTLC方法。

【液相色譜（HPLC）法】

由于具有穩(wěn)定、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，HPLC法已成為當(dāng)前進(jìn)行黃曲霉毒素定量研究的方法。分析黃曲霉毒素的液相色譜方法包括正相液相色譜方法（NPLC）和反相液相色譜方法（RPLC）。反相液相色譜(RP-HPLC)系統(tǒng)易操作，流動(dòng)相具有低毒性，可同時(shí)分離、分析樣品中黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2且不受樣品沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性、和分子量限制，所以目前使用熒光檢測(cè)器的反相HPLC法已經(jīng)成為檢測(cè)黃曲霉毒素的主要測(cè)定方法。

Chiavaro等根據(jù)不同環(huán)式糊精增強(qiáng)黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1熒光釋放的不同效果，發(fā)展了將環(huán)式糊精加入到流動(dòng)相中的液相色譜法，黃曲霉毒素 B1，B2，G1，G2 的檢測(cè)限均在0.3μg／kg以下，M1的檢測(cè)限在0.0005μg／kg以下，幾種黃曲霉毒素都呈線性反應(yīng)關(guān)系。這種方法也被用于測(cè)定自然污染及人工添加樣品。

【免疫學(xué)方法】

黃曲霉毒素的免疫學(xué)檢測(cè)方法是將生物大分子的免疫學(xué)特性與化學(xué)特性結(jié)合起來的檢測(cè)方法。該方法具有快速、靈敏、對(duì)樣品純度要求不高的特點(diǎn)，特別適合于大批量樣本的檢測(cè)。用于檢測(cè)黃曲霉毒素的免疫學(xué)方法有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、放射免疫測(cè)定法、親和層析法、熒光偏振免疫測(cè)定法及免疫層析法。

1.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法

ELISA法是在免疫學(xué)和細(xì)胞工程學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展出來的一種微量檢測(cè)技術(shù)，分為直接法、間接法、雙抗體夾心法和競(jìng)爭(zhēng)法，其優(yōu)點(diǎn)是對(duì)黃曲霉毒素B1的檢測(cè)定性定量準(zhǔn)確而且檢測(cè)速度快（比薄層法提高了近 200倍），特異性強(qiáng)，熒光物質(zhì)、色素、結(jié)構(gòu)類似物對(duì)結(jié)果無干擾，回收率高，提取方法簡(jiǎn)單，成本較低，特別適合于對(duì)黃曲霉毒素Bl污染監(jiān)測(cè)控制中大量樣品的篩查。缺點(diǎn)是ELISA法中酶的活性易受反應(yīng)條件影響，測(cè)定結(jié)果重復(fù)性較差，測(cè)定結(jié)果易出現(xiàn)假陽性問題；此外ELISA試劑壽命短，需要低溫保存，葡萄酒類、含鹽量高的醬油、含脂量高的花生油在提取時(shí)要進(jìn)行調(diào)節(jié)pH 值、脫鹽、脫脂等特殊處理。

2.親和層析法

親和層析法利用免疫化學(xué)反應(yīng)原理，采用大劑量的單克隆抗體，選擇性吸附提取液中的抗原物質(zhì)黃曲霉毒素。由于抗原-抗體反應(yīng)具有高靈敏、高選擇、高特異性等特點(diǎn)，從而大大提高了試樣的凈化效果及檢測(cè)靈敏度，同時(shí)可顯著減少有毒有害試劑的使用，有利于操作人員的身體健康和環(huán)境保護(hù)。

3.放射免疫(RIA)法

RIA法與ELISA法基本相似，不同的是它們所使用的標(biāo)記物不同，ELISA 法的標(biāo)記物為酶，RIA法所用的標(biāo)記物一般為放射性元素氚(3H)。該方法是將毒素 -3H標(biāo)記物與樣品加抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，除去未結(jié)合的部分，測(cè)定其放射性，放射性強(qiáng)則說明樣品中毒素含量低，反之毒素含量高。實(shí)驗(yàn)證明 ELISA比RIA靈敏度更高且更簡(jiǎn)便，并且RIA需要特殊設(shè)備，有放射性元素污染問題，人員需要安全防護(hù)，現(xiàn)在已經(jīng)很少使用。

4.熒光偏振免疫測(cè)定法

熒光偏振免疫測(cè)定法的主要原理是熒光標(biāo)記的毒素在樣品緩沖液中與未熒光標(biāo)記的毒素對(duì)特異性抗體的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。分子質(zhì)量越大，分子旋轉(zhuǎn)速度越慢，熒光偏振值越大。Nasir等報(bào)道了用基于熒光偏振的裝置檢測(cè)不同谷物中的黃曲霉毒素。

5.免疫層析（IC）法

IC法是20世紀(jì)80年代初發(fā)展起來的一種快速免疫分析技術(shù)，其操作簡(jiǎn)單，快速，人員不用培訓(xùn)，且不需特殊的儀器設(shè)備，非常適用于現(xiàn)場(chǎng)測(cè)試和進(jìn)行大量樣品的初篩。

免疫學(xué)與儀器結(jié)合方法